Cukrzyca i receptory GPCR – nowe możliwości terapeutyczne

Czy cukrzyca i receptory GPCR stwarzają nowe możliwości terapeutyczne?

Cukrzyca (Diabetes Mellitus) stanowi istotny problem zdrowia publicznego ze względu na rosnącą częstość występowania oraz powiązane obciążenia chorobowe, takie jak otyłość, choroby sercowo-naczyniowe, nadciśnienie, niewydolność nerek, utrata wzroku czy owrzodzenia stóp. Cukrzyca jest przewlekłą chorobą metaboliczną charakteryzującą się hiperglikemią wynikającą z defektów wydzielania insuliny, działania insuliny lub obu tych czynników. Ponieważ utrata wydzielających insulinę komórek beta trzustki jest charakterystyczną cechą zarówno cukrzycy typu 1 (T1D), jak i typu 2 (T2D), które są najczęstszymi postaciami cukrzycy, badania mające na celu kompensację utraty komórek beta zyskały ostatnio na znaczeniu.

Receptory sprzężone z białkiem G (GPCRs) stanowią największą rodzinę receptorów powierzchniowych komórek, obejmującą około 800 członków ludzkiego genomu. GPCRs są potencjalnymi celami terapeutycznymi ze względu na ich rolę w regulacji różnych procesów fizjologicznych, a ich dostępność czyni je atrakcyjnymi celami farmakologicznymi. GPR75 został zidentyfikowany jako receptor kwasu 20-hydroksyeikozatetraenowego (20-HETE), który jest metabolitem kwasu arachidonowego wpływającym na równowagę glukozy, sygnalizację insulinową oraz funkcje wytwarzane przez rodzinę enzymów cytochromu P450 (CYP) 4A i 4F. Wykazano, że GPR75 odgrywa istotną rolę w kontroli glikemii i wrażliwości na insulinę, a mutacje utraty funkcji GPR75 mają działanie ochronne przed otyłością. GPR56, białko kodowane przez gen ADGRG1, charakteryzuje się jako członek rodziny GPCR. GPR56 ulega wysokiej ekspresji zarówno w ludzkich, jak i mysich wyspach trzustkowych i ma potencjał terapeutyczny w leczeniu cukrzycy. Dodatkowo wykazano, że GPR56 odgrywa ważną rolę w funkcjach i przeżyciu komórek β. Receptor muskarynowy acetylocholiny (M3R) jest receptorem acetylocholiny i został powiązany ze stymulacją wydzielania insuliny. Receptor kannabinoidowy 1 (CB1R) jest receptorem kannabinoidowym sprzężonym z białkiem G, kodowanym przez gen CB1R u człowieka. Wykazano, że CB1R odgrywa aktywną rolę w regulacji funkcji komórek beta trzustki i stymuluje uwalnianie insuliny. Te geny zostały włączone do naszego badania ze względu na ich zdefiniowane role w wydzielaniu insuliny i przeżyciu komórek β.

Czy liraglutyd rewolucjonizuje leczenie komórek beta?

Liraglutyd, jako analog peptydu glukagonopodobnego 1 (GLP-1) i agonista receptora GLP-1 (GLP-1R), jest szeroko stosowany jako lek przeciwcukrzycowy na całym świecie w leczeniu cukrzycy typu 2 w ostatnich latach. Liraglutyd wywiera swoje działanie poprzez receptor GLP-1R i skutecznie naśladuje działanie GLP-1, który jest hormonem inkretynowym obniżającym poziom glukozy we krwi. GLP-1 i jego analogi są związane nie tylko z indukcją zależnego od glukozy wydzielania insuliny, ale także z hamowaniem uwalniania glukagonu i tłumieniem apetytu. Na poziomie komórkowym stymulują one replikację komórek beta trzustki, neogenezę i różnicowanie. Hamują apoptozę komórek β poprzez zmniejszenie stresu komórkowego. Prowadzi to do zmniejszenia insulinooporności przy jednoczesnej poprawie odpowiedzi wydzielania insuliny indukowanej glukozą. Dlatego odpowiedź GLP1R na liraglutyd jest przedmiotem dużego zainteresowania, szczególnie w przypadku długotrwałego podawania i braku odpowiedzi na liraglutyd.

Badanie miało na celu wyjaśnienie wpływu liraglutydu na ekspresję genów GPR75, GPR56, GLP1R, M3R i CB1R w mysich komórkach beta trzustki NIT-1, oferując wgląd w jego mechanizmy komórkowe. Dąży również do identyfikacji nowych celów komórkowych, które mogą być wykorzystane w połączeniu z liraglutydem w celu poprawy wydzielania insuliny i przeżycia komórek β jako potencjalne działanie przeciwhiperglikemiczne.

Czy terapie skojarzone zmienią leczenie cukrzycy?

W badaniu komórki beta trzustki NIT-1 (ATCC CRL-2055) były hodowane w DMEM z 10% FBS, 1% L-glutaminą, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 100 μg/ml amfoterycyny B w temperaturze 37°C z 5% CO₂. Po wysianiu 50 000 komórek w 6-dołkowych płytkach, traktowano je liraglutydem w stężeniach 10 nM, 100 nM, 1000 nM w obecności nieleczonych grup kontrolnych dla każdego stężenia i punktów czasowych. Po upływie 30, 60 i 120 minut przeprowadzono izolację całkowitego RNA za pomocą zestawu Pure Link (Ambion) i syntezę cDNA za pomocą zestawu High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific). Poziomy mRNA genów GPR75, GPR56, GLP1R, M3R, CB1R oraz genu kontrolnego aktyny określono metodą real-time qPCR (Applied Biosystems). Zmiany w poziomach mRNA między grupami oceniono za pomocą metody ddCT. Dane analizowano przy 95% przedziale ufności za pomocą SPSS 20.0, stosując jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA) do identyfikacji różnic statystycznych między grupami eksperymentalnymi. Test post-hoc Tukeya zastosowano do porównań parami, jeśli wykryto istotne różnice. Istotność ustalono na poziomie p < 0,05 na podstawie wyników analizy.

W badaniu nie wykryto zmian zależnych od czasu i dawki we wszystkich badanych genach. Zamiast tego zaobserwowano statystycznie istotny wzrost poziomów mRNA genów GPR75, GPR56, M3R i CB1R po 60 minutach przy 10 nM liraglutydu oraz niewielki i statystycznie istotny spadek poziomów mRNA GLP1R w odpowiedzi na leczenie 1000 nM liraglutydu w porównaniu do stężeń 10 nM i 100 nM we wszystkich badanych punktach czasowych. Zbadano zmiany w poziomach mRNA genów GPR75, GPR56, GLP1R, M3R i CB1R znanych jako członkowie rodziny GPCR po leczeniu liraglutydem in vitro w mysich komórkach beta trzustki, ponieważ zmiany w ekspresji genów mogą pomóc zrozumieć wpływ liraglutydu na komórki beta, zidentyfikować cząsteczki pośredniczące i zbadać nowe cele przeciwcukrzycowe. Mimo braku zależności czasowej i dawkowej, stwierdzono statystycznie istotny wzrost poziomów ekspresji genów GPR75, GPR56, M3R i CB1R przy 10 nM liraglutydu w 60. minucie. Ponadto ekspresja genu GLP1R pozostała niezmieniona po zastosowaniu różnych stężeń liraglutydu, z wyjątkiem niewielkiego, ale statystycznie istotnego spadku poziomów mRNA GLP1R w odpowiedzi na leczenie 1000 nM liraglutydu w porównaniu do stężeń 10 nM i 100 nM liraglutydu we wszystkich badanych punktach czasowych.

GLP-1 zwiększa wydzielanie insuliny indukowane glukozą, obniżając poziom glukozy we krwi. Liraglutyd jest acylowanym analogiem ludzkiego GLP-1 o 97% podobieństwie aminokwasowym do naturalnego peptydu glukagonopodobnego-1 (GLP-1). Jako analog GLP-1, liraglutyd obniża poziom glukozy we krwi poprzez zwiększenie wydzielania insuliny. GLP-1 jest najbardziej znany z obniżania poziomu glukozy we krwi u osób z cukrzycą. Jednakże wykazano również, że zmniejsza stres retikulum endoplazmatycznego, reguluje autofagię, promuje przeprogramowanie metaboliczne, stymuluje sygnalizację przeciwzapalną i zmienia ekspresję genów. Wiązanie ligandu z GLP1R inicjuje aktywację związanej z błoną cyklazy adenylowej, co zapoczątkowuje kaskadę obejmującą produkcję cyklicznego adenozynomonofosforanu (cAMP). Efekty pośredniczone przez GLP1R wywołują natychmiastową kaskadę sygnałową, która może wpływać na uwalnianie insuliny i napływ wapnia z powodu szybkich modyfikacji potranslacyjnych. Może to również wystąpić w wyniku efektów późnego stadium lub efektów przewlekłych, które mogą działać jako modulacja ekspresji genów lub metabolizmu komórkowego.

Chociaż szlaki sygnałowe aktywowane przez leczenie liraglutydem w komórkach beta trzustki zostały częściowo wyjaśnione, istnieją ograniczone informacje na temat profilu ekspresji genów, który zmienia się w odpowiedzi na liraglutyd. Podczas gdy z literatury można oczekiwać, że ekspresja genu GLP1R wzrośnie w komórkach traktowanych liraglutydem, w naszym badaniu zaobserwowano, że ekspresja genu GLP1R była stabilna, z wyjątkiem 1000 nM liraglutydu, który spowodował statystycznie istotny spadek (p < 0,05) w porównaniu do zarówno 10 nM, jak i 100 nM liraglutydu. Wynik ten sugeruje, że czas trwania i dawka liraglutydu mogą prowadzić do nieoczekiwanych zmian w ekspresji genów. Gençoğlu i wsp. (2019) wykazali, że ligandy CCL5 (agonista GPR75), ACEA (agonista CBR1), eksenatyd (agonista GLP1R) i CCh (agonista M3R) zwiększają wydzielanie insuliny w mysich komórkach insulinoma MIN6 oraz że receptory docelowe tych ligandów, geny GPR75, GPR56, M3R i GLP1R były ekspresjonowane w tych komórkach. Badanie zidentyfikowało te ligandy jako potencjalne środki lecznicze ze względu na ich zdolność do zwiększania wydzielania insuliny.

Wyniki badania pokazują, że ekspresja genów GPR75, GPR56, M3R i CB1R może pośredniczyć w wcześniej zidentyfikowanych funkcjach liraglutydu w komórkach beta trzustki. Biorąc pod uwagę implikacje tych ustaleń, GPR75, GPR56, M3R i CB1R wyłaniają się jako obiecujący kandydaci na nowe cele terapeutyczne w leczeniu cukrzycy i otyłości, szczególnie w połączeniu z liraglutydem, oraz u pacjentów słabo reagujących lub niereagujących na liraglutyd. Ukierunkowanie na geny GPR75, GPR56, M3R i CB1R może poprawić efekt liraglutydu. Ustalenia te są ważne w identyfikacji genów GPR75, GPR56, M3R i CB1R jako celów do bardziej szczegółowych i funkcjonalnych badań. Przyszłe badania powinny dalej eksplorować mechanistyczne szlaki i kliniczne implikacje tych GPCR.

W badaniu przeprowadzonym przez Amisten i wsp. (2013) zbadano ligandy peptydowe/białkowe i ekspresję ludzkich GPCR wysp trzustkowych oraz stworzono atlas tych GPCR. Atlas został opracowany w celu zbadania interakcji GPCR z ich endogennymi ligandami, mechanizmów regulacji wydzielania hormonów wysp trzustkowych oraz interakcji lek-receptor, które mogą wpływać na uwalnianie insuliny. Badanie wykazało, że mRNA kodujące GPR56 było najbardziej obfite w ludzkich wyspach trzustkowych i że wchodzi ono w interakcję z kolagenem alfa-1 i aktywuje szlak sygnałowy RhoA. GPR75 został zidentyfikowany jako nowy receptor chemokin aktywowany przez CCL5 i sugerowano, że może odgrywać rolę w procesach autoimmunologicznych poprzez kierowanie limfocytów do wysp trzustkowych. Ponadto aktywacja GLP1R promuje uwalnianie insuliny i somatostatyny poprzez zwiększenie produkcji cAMP i wzmacnia wydzielanie insuliny stymulowane glukozą poprzez hamowanie uwalniania glukagonu.

Podsumowanie

Badanie koncentrowało się na analizie wpływu liraglutydu na ekspresję genów w komórkach beta trzustki. Wykazano statystycznie istotny wzrost poziomów mRNA genów GPR75, GPR56, M3R i CB1R po 60 minutach przy stężeniu 10 nM liraglutydu. Zaobserwowano również niewielki spadek poziomów mRNA GLP1R w odpowiedzi na leczenie 1000 nM liraglutydu. Receptory GPCR, w tym GPR75 i GPR56, okazały się potencjalnymi celami terapeutycznymi w leczeniu cukrzycy ze względu na ich rolę w regulacji wydzielania insuliny i przeżycia komórek beta. Liraglutyd, jako analog GLP-1, skutecznie obniża poziom glukozy we krwi poprzez zwiększenie wydzielania insuliny i może wpływać na ekspresję genów w komórkach beta trzustki. Wyniki sugerują, że kombinacja liraglutydu z terapiami ukierunkowanymi na GPR75, GPR56, M3R i CB1R może prowadzić do skuteczniejszego leczenia cukrzycy.